Microscopía láser confocalThis is a featured page

Fecha, profesores y objetivos

[FECHA], Magdalena García, [OBJETIVOS]

Memoria

FUNDAMENTOS DE LA TÉCNICA
En la microscopía confocal se reconocen estructuras en las que la luz emitida o reflejada por una muestra se concentra en un solo plano focal y se superpone a toda luz que no procede de dicho plano.

En un barrido puntual confocal, las lentes del microscopio enfocan la luz láser sobre un solo punto de la muestra (el punto focal). A continuación, el láser explora la muestra punto por punto y genera la imagen barrida. La fluorescencia y la luz reflejada por la muestra vuelven atravesando el objetivo. El microscopio y el sistema óptico del módulo de barrido enfocan la luz emitida por el punto focal sobre un segundo plano, el punto confocal. A través de la pequeña abertura de este punto (denominada pinhole), la luz del punto focal llega hasta el detector. La luz que no procede de este foco no atraviesa la abertura.

El principio confocal se representa de forma esquemática para la microscopía de epifluorescencia. Como en otros microscopios de epifluorescencia, la lente se utiliza al mismo tiempo como condensador y como objetivo. La gran ventaja es que desaparece la necesidad de equilibrar dos lentes con exactitud y ajustarlas entre sí. Un difusor de rayos (un espejo dicroico) refleja el rayo láser colimado y polarizado que se introduce a través de una ranura sobre la parte trasera de la lente del objetivo y lo enfoca sobre la muestra. La luz que refleja la muestra vuelve a atravesar la misma lente. El rayo de luz se enfoca a través del pinhole (es decir, la ranura confocal) para excluir, de esta forma, la luz extrafocal, es decir, la emitida por zonas de la muestra que están por encima o por debajo del plano focal. El volumen del corte óptico depende de diferentes parámetros como el diámetro (variable) de la abertura y la longitud de onda. Un detector sensible a la luz (por ejemplo un fotodiodo) colocado tras la abertura confocal registra los datos intrafocales de cada punto de la muestra. La señal de salida analógica se digitaliza y se transmite a un ordenador.

El detector consiste en un detector puntual que sólo recibe la luz de un punto de la muestra. De esta forma, el microscopio confocal permite observar sólo un punto de la muestra en cada momento, a diferencia del microscopio convencional con el que puede verse una zona mayor de la muestra. Así, la imagen completa de la muestra sólo se consigue mediante la exploración punto por punto de ésta, para lo cual debe desplazarse el punto luminoso o la muestra. Ambas posibilidades han conducido al desarrollo de dos tipos diferentes de microscopios confocales:


  • Microscopios con platina móvil (barrido en etapas): la platina con la muestra se desplaza un poco tras cada exposición mientras que el sistema óptico permanece quieto.
  • Microscopios con técnica de rayo o de espejo: el punto luminoso se desplaza sobre la muestra que se encuentra fija y la recorre punto por punto con ayuda de pequeños y rápidos espejos accionados mediante un galvanómetro como los que utiliza Leica.
El sistema TCS SP2 de Leica permite crear un solo plano focal, así como toda una serie de planos (horizontales o verticales). Un corte único vertical o un barrido xz, ofrece una vista lateral de la muestra.

La recogida de una secuencia de cortes ópticos de la muestra como lote de imágenes y su posterior procesamiento digital presenta la ventaja de que este bloque de datos de varias dimensiones permite generar una imagen bidimensional calculada (proyección) o una representación reducida en 3 dimensiones de la muestra en un ordenador apropiado.

Poder resolutivo óptico

El término resolución hace referencia a la capacidad de distinguir entre los detalles más precisos de una estructura. En un microscopio ideal, el sistema óptico estaría libre de todo tipo de aberraciones. En este instrumento hipotético, el poder resolutivo estaría limitado exclusivamente por la difracción. Ésta puede definirse como la distancia más pequeña entre dos puntos de una muestra a la que éstos puntos pueden verse siempre como puntos separados (criterio Rayleigh). A partir de éste límite, ambos puntos se fusionan entre sí (es decir, los aros de difracción se superponen de forma parcial o total) y no pueden reconocerse como dos puntos independientes. Esta distancia se calcula a partir del tamaño de una imagen de difracción de un punto minúsculo de la muestra. Corresponde al radio del primer mínimo de esta imagen de difracción. Esto, a su vez, depende de la apertura numérica del objetivo y del condensador. La apertura numérica se define mediante el coeficiente de refracción de la lente y el tamaño del compás de vara que puede penetrar. De forma análoga la argumentación anterior, la resolución axial puede definirse como el radio del primer mínimo a lo largo del eje del microscopio de la imagen de difracción de un objeto puntual.

De acuerdo con la teoría de imágenes de difracción en 3 dimensiones de este tipo, el poder resolutivo a lo largo del eje z es dos veces menor que el poder resolutivo óptico lateral. De esta forma, la resolución óptica a lo largo del eje z alcanza aproximadamente la mitad de la resolución del plano focal. El microscopio TCS SP2 de LEICA consiste en un sistema de barrido de puntos con gran sensibilidad y resolución teórica en los ejes x, y, z, que no acepta condiciones. La resolución de barrido se refiere a la nitidez de enfoque que está determinada por el número y el tamaño del píxel. Cuanto mayor es el número de píxeles y mayor el formato de barrido seleccionado, más sencillo resulta distinguir entre dos objetos próximos entre sí. La resolución de barrido está limitada por el poder resolutivo óptico máximo.

Detección
La formación de imágenes confocales, es decir, la medición de las características ópticas de cantidades muy pequeñas de una muestra no está limitada únicamente por la calidad óptica del microscopio. Otras limitaciones son:

  • El hecho de que las muestras continuas se miden (debido a la toma de muestras y al procesamiento digital) sólo en pequeñas cantidades individuales de muestra.
  • La exactitud con la que se definen estas pequeñas cantidades, que se determina mediante el mecanismo de barrido.
  • La potencia de la fuente de luz en relación con el potencial de reflexión de la muestra.
  • La sensibilidad y el ruido del detector.
También el detector es un componente central del microscopio confocal. Debido a su elevada relación entre señal y nivel de ruido, LEICA Microsystems Heidelberg utiliza fotomultiplicadores como detectores.

Edición de imagen
En los primeros microscopios confocales, el detector estaba conectado a un osciloscopio con fosforescencia y la imagen se mostraba de la forma en que se producía el barrido. En la actualidad, en primer lugar se procesa la señal digitalmente y después se muestra en un ordenador. De esta forma existe la posibilidad de modificar la imagen mostrada de diferentes formas. Las posibilidades son las siguientes:

  • Incremento del contraste mediante valores umbral, extensión de contraste lineal y la corrección Gamma (curva del valor de intensidad de la imagen frente a la representación gráfica de la intensidad de la fuente).
  • Doble exposición de imágenes en experimentos.
  • Filtro digital para la ampliación de los bordes, el alisado, la eliminación de interferencias, etc.
  • Reconstrucción de vistas tridimensionales con ayuda de cortes ópticos recogidos en lotes de imágenes. Esto permite, por ejemplo, la reconstrucción de una imagen en un plano xz mediante lotes de imágenes de planos xy. Al mismo tiempo, pueden generarse modelos tridimensionales completos de la muestra y examinarse desde cualquier dirección.
  • Composición de películas digitales mediante las series temporales tomadas con el microscopio.

Cuantificación y mediciones
Este tipo de edición de imágenes no incrementa la calidad de los datos recogidos; sin embargo, permite mejorar la vista y facilitar la interpretación cualitativa de los datos.

Fuente luminosa
El láser se adapta como fuente luminosa de forma excepcional a la microscopía confocal, ya que proporciona una luz muy clara y el rayo presenta una desviación muy pequeña. Al mismo tiempo, su enfoque es sencillo y su intensidad muy estable. Precisamente esta estabilidad cobra especial importancia en las mediciones cuantitativas.

Integración
El TCS SP2 de Leica está concebido como sistema integral. Todos los elementos ópticos y mecánicos trabajan de forma continua con el hardware y el software del ordenador. El Leica Confocal Software incluido con el microscopio permite todo el proceso de generación de imágenes, desde los cortes ópticos, pasando por la edición y el análisis de las imágenes (la principal aplicación del software) hasta la impresión de las imágenes creadas mediante una impresora.

APLICACIONES
Las aplicaciones de la técnica son muy numerosas principalmente dentro de las ciencias biológicas: biología celular, biología molecular, fisiología, etc. Ya que permite identificar y localizar componentes moleculares específicos con la particularidad de que al no ser una técnica destructiva permite una observación in vivo.

Dentro de la ciencia de materiales también encuentra aplicación en la observación de la morfología o los defectos en sólidos como componentes microelectrónicos, polímeros, resinas, depósitos, minerales, cerámicas, metales, etc
Retina.
Cortesía del Dr. Nicolás Cuenca.
Dep. Biotecnología		 Microscopía láser confocal - MbbUA
REQUISITOS Y LIMITACIONES
En general las muestras a observar en el microscopio confocal deben ser planas, bien sean cortes de material biológico o muestras pulidas de materiales sólidos. El microscopio es invertido por lo tanto las muestras deben ir provistas de un cubreobjetos de 0.17 mm. De este modo se optimiza el funcionamiento de los objetivos al mismo tiempo que se protegen. En el caso de cultivos o disoluciones éstos deben estar contenidos en un recipiente (tipo placa Petri) cuyo fondo sea de 0.17 mm de grosor, lo que equivaldría al cubreobjetos en el caso de cortes.

DESCRIPCIÓN DEL EQUIPO
El microscopio láser confocal con el que cuenta la unidad es de la marca LEICA. Es un microscopio confocal espectral. Cuenta con un microscopio invertido DM IRBE2 para campo claro en luz transmitida y fluorescencia en luz incidente con una dotación óptica para contraste interferencial. Lleva tres filtros de fluorescencia:
  • I3 (excitación azul BP 450-490; emisión LP 515) para FITC, Cy2, etc.
  • N2.1 (excitación verde BP 515-560; emisión LP 590) para TRITC, Cy3, etc.
  • A (excitación UV BP 340-380; emisión LP 425) para AMCA o DAPI, etc.
El microscopio tiene cinco objetivos, dos de ellos secos 10x y 20x y tres de inmersión 40x, 63x y 100x.

El módulo confocal espectral SP2 es un módulo con sistema de detección espectral altamente sensible en el rango de 400 a 850 nm. Tiene tres canales de detección para luz reflejada o fluorescencia. El sistema incluye tres fuentes de láser: Rojo (HeNe 633 nm), Verde (HeNe 543 nm) y Azul (Ar 458 nm, 476 nm, 488 nm y 514 nm). Microscopía láser confocal - MbbUA

La platina del microscopio es galvanométrica de alta precisión y alta velocidad para controlar el eje Z.

Existe también un detector de luz transmitida para registrar imágenes de campo claro mediante el módulo confocal.

Microscopía láser confocal - MbbUA
 		EQUIPO COFINANCIADO POR LA UNIÓN EUROPEA A TRAVÉS DEL FONDO EUROPEO DE DESARROLLO REGIONAL
 		Microscopía láser confocal - MbbUA

EXPERIENCIA DEL EQUIPO
Se han llevado a cabo análisis de muestras tanto biológicas como de ciencia de materiales. Entre las muestras biológicas cabe destacar el análisis de retinas y bacterias. Entre las muestras de ciencia de materiales se ha estudiado la superficie de materiales compuestos.
PERSONAL
 Dra. Cristina Almansa Carrascosa

Referencias

http://www.ua.es/es/investigacion/sti/servicios/analisis_instrumental/microscopia/confocal.html


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